Uma dieta cetogênica aumenta a longevidade e a longevidade de ratos adultos

  • •Uma dieta cetogênica com pouco carboidrato aumenta a longevidade em ratos machos adultos
  • •Função motora, memória e massa muscular são preservadas em camundongos cetogênicos idosos
  • •A acetilação da proteína é aumentada no fígado e músculo esquelético de camundongos cetogênicos

Sumário

A restrição calórica, sem desnutrição, demonstrou aumentar a expectativa de vida e está associada a uma mudança da glicólise para a oxidação beta. O objetivo deste estudo foi imitar essa mudança metabólica usando dietas com pouco carboidrato e determinar a influência dessas dietas na longevidade e no tempo de vida em ratos.

 Os camundongos C57BL / 6 foram designados para uma dieta cetogênica, com pouco carboidrato ou controle aos 12 meses de idade e foram autorizados a viver sua vida útil natural ou testados quanto à função fisiológica após 1 ou 14 meses de intervenção dietética. A dieta cetogênica (KD) aumentou significativamente a vida média e a sobrevida em comparação aos controles. Em camundongos idosos, apenas aqueles que consomem KD apresentaram preservação da função fisiológica. O KD aumentou os níveis de acetilação da proteína e regulou a sinalização de mTORC1 de maneira dependente do tecido.

Resumo Gráfico

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Palavras-chave

Introdução

A restrição calórica (RC) estende a longevidade e atrasa as doenças relacionadas à idade em vários modelos animais (Speakman e Mitchell, 2011)

 Embora os mecanismos exatos que contribuem para o aumento da longevidade em animais com RC ainda estejam em debate, a RC induz uma mudança do metabolismo de carboidratos para o de gordura (Bruss et al., 2010

Resta determinar se o aumento da oxidação e cetogênese de ácidos graxos que ocorrem com a CR contribui para a extensão da vida útil.Dietas com pouco carboidrato (LCDs) também induzem uma mudança no metabolismo dos carboidratos para a oxidação de ácidos graxos. 

O LCD mais extremo, a dieta cetogênica (KD), demonstrou promover um estado metabólico anti-inflamatório e aumentar os níveis de corpos cetônicos em camundongos, lembrando os principais recursos da RC (Meidenbauer et al., 2014

Apesar dessas semelhanças, há escassez de informações sobre os resultados de vida e saúde de animais mantidos a longo prazo nessas dietas. Até o momento, apenas um estudo mostrou que camundongos alimentados com uma vida inteira, ad libitum KD, não demonstram diferença significativa na longevidade em comparação com camundongos alimentados com uma dieta padrão da comida (Douris et al., 2015

No entanto, os controles e os camundongos KD C57BL / 6 usados ​​por Douris e colegas tiveram vida curta para essa cepa de camundongo e, portanto, o efeito de uma KD no envelhecimento ainda é ambíguo, especialmente em animais que não são obesos ou alimentados ad libitum.

No presente estudo, ratos adultos foram alimentados com quantidades isocalóricas de uma dieta controle, LCD ou KD. O objetivo deste estudo foi determinar a influência de um LCD ou KD na longevidade e na saúde dos ratos.

Resultados

 Uma dieta cetogênica aumenta a longevidade e a saúde de ratos magros

Para estudar os efeitos dos LCDs na longevidade em camundongos machos adultos, comparamos um LCD (70% kcal de gordura) e um KD (89% kcal de gordura) com uma dieta controle (65% kcal de carboidratos). As dietas foram alimentadas em quantidades isocalóricas a partir dos 12 meses de idade. O tempo de vida aumentou significativamente no KD em comparação ao grupo controle ( Figura 1 A), com o grupo cetogênico mostrando um aumento de 13,6% no tempo médio de vida em comparação aos ratos controle. 

O grupo LCD teve uma vida útil intermediária para os grupos KD e controle e não foi significativamente diferente de nenhum dos grupos. O tempo médio de vida foi de 886, 943 e 1.003 dias para os grupos controle, LCD e KD, respectivamente. 

Tempo de vida máximo (90 thpercentil) foi de 1.064, 1.123 e 1.175 dias, respectivamente. Mediana, mas não máxima (p = 0,16), a vida útil aumentou significativamente no grupo KD versus controle. De interesse específico, a incidência de tumores no momento da morte, particularmente o sarcoma histiocítico, diminuiu com um KD ( Tabela S1 ).

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Figura 1 Efeito de dietas com baixo teor de carboidratos na longevidade e no tempo de vida em ratos machosMostrar legenda completaVer imagem ampliadaVisualizador de figuraDownload da imagem em alta resoluçãoDownload (PPT)

Para avaliar os efeitos dessas dietas sobre a saúde, uma bateria de testes físicos e comportamentais foi realizada após 1 ou 14 meses da intervenção alimentar (13 ou 26 meses de idade). 

Os resultados do novo teste de reconhecimento de objetos (Leger et al., 2013) ( Figura 1 B) indicam que a memória foi preservada em camundongos idosos alimentados com KD em comparação com aqueles alimentados com um controle ou LCD. 

Coordenação, força e resistência foram avaliadas com os testes de suspensão de arame e força de preensão. Camundongos machos alimentados com KD por 14 meses foram mais resistentes à queda do fio pendurado ( Figura 1 C) e apresentaram maior força de preensão no membro anterior ( Figura 1 D) em comparação aos controles da mesma idade. 

Camundongos cetogênicos antigos também foram mais rápidos no teste de velocidade Locotronic (Rousselet et al., 2003) ( Figura 1 E) e mais ativos durante o teste de criação ( Figura 1 F) em comparação aos controles, sugerindo melhor preservação da coordenação motora. Na maioria dos casos, o desempenho do grupo de LCD foi intermediário para os grupos controle e cetogênico. 

Notável e consistente com o aumento da função motora, a massa relativa do gastrocnêmio e de outros músculos dos membros posteriores foi maior nos camundongos KD antigos ( Figuras 1 G – 1I e S1 ). No total, esses testes sugerem que o KD é capaz de prolongar a vida útil e a saúde dos ratos adultos.

 Dietas com pouco carboidrato alteram a fisiologia e o metabolismo

Para investigar as alterações fisiológicas e metabólicas induzidas por essas dietas, medimos o peso corporal (PC) e a composição, um painel de biomarcadores séricos, gasto energético e atividade física. Apesar de serem alimentados com a mesma quantidade de calorias, os ratos alimentados com um LCD foram mais pesados ​​durante o estudo do que os ratos alimentados com um controle ou KD ( Figura 2 A). 

A análise da composição corporal mostrou que a massa magra aumentou com a idade nos camundongos controle e LCD e foi significativamente menor nos camundongos KD aos 26 meses de idade ( Figura S1 ). 

Os camundongos LCD apresentaram significativamente mais massa gorda em comparação aos camundongos controle ou cetogênicos ( Figura 2 B). Em todos os grupos de dieta, a massa total de gordura atingiu o pico aos 17 meses de idade.

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Figura 2 Adaptações metabólicas de ratos machos a dietas com baixo teor de carboidratosMostrar legenda completaVer imagem ampliadaVisualizador de figuraDownload da imagem em alta resoluçãoDownload (PPT)

Os níveis circulantes de β-hidroxibutirato (βHB) foram medidos 3 horas pós-prandial ( Figura 2 C). Em ambos os grupos etários, as cetonas no sangue foram significativamente elevadas nos camundongos KD, em comparação aos controles ou LCD. Também analisamos outros biomarcadores séricos após 1 e 14 meses de intervenção alimentar ( Tabela S2 ). Não foram detectadas alterações entre as dietas aos 13 meses de idade. 

Aos 26 meses de idade, a única diferença observada foi que a concentração de ácidos graxos livres foi maior no LCD em comparação aos outros grupos.Quociente respiratório (RQ), gasto energético (EE) e atividade física foram medidos em camundongos aos 13 e 26 meses de idade. 

Em ambas as idades, o RQ médio foi diminuído por um LCD ou um KD em comparação com uma dieta controle ( Figura 2 D; Tabela S3 ). Não foram observadas diferenças significativas entre as dietas em 24 horas de EE; no entanto, o envelhecimento diminuiu o EE, não ajustado ou ajustado para peso corporal ou massa magra, em todos os grupos de dieta ( Tabela S3 ). No geral, a atividade física espontânea não diferiu com a idade ou entre os grupos de dieta aos 13 ou 26 meses de idade ( Tabela S3 ).

Testes de tolerância à glicose e insulina (GTT e ITT) foram realizados em camundongos após 1 mês de intervenção na dieta. Os camundongos em um KD apresentaram tolerância à glicose diminuída em comparação com aqueles em uma dieta controle ( Figura 2 E). 

O grupo LCD não diferiu no descarte de glicose em comparação aos grupos controle ou KD. Embora não tenham sido observadas diferenças entre os camundongos controle e os outros grupos, a sensibilidade à insulina após um jejum de 4 horas foi aprimorada por um KD se comparado ao LCD ( Figura 2F), indicando que a sinalização da insulina está funcionando normalmente em camundongos alimentados com um KD. 

Curiosamente, os níveis hepáticos de AS-160 fosforilado (substrato Akt de 160 kDa), um importante mediador da sensibilidade à insulina, aumentaram em camundongos cetogênicos em comparação com as outras dietas ( Figura S2) Os níveis circulantes do fator de crescimento 21 dos fibroblastos (FGF21) não foram significativamente alterados por nenhuma das intervenções alimentares ( Tabela S2 ).

Para caracterizar ainda mais a mudança metabólica nessas dietas, analisamos o conteúdo de proteínas de várias enzimas ligadas ao metabolismo de ácidos graxos no fígado desses camundongos. Um KD diminuiu os níveis hepáticos de acetil-CoA carboxilase fosforilada e total (ACC), enquanto aumentou os da carnitina palmitoiltransferase 2 (CPT2) e da acil-CoA desidrogenase de cadeia média (MCAD) ( Figuras 2 G-2L). Os níveis de proteína fosforilada e total de piruvato desidrogenase (PDH) também foram reduzidos por LCD e KD ( Figuras 2 H e 2K).

 Uma dieta cetogênica aumenta a acetilação de proteínas e modula a sinalização de mTORC1 de maneira específica ao tecido

O βHB pode inibir a atividade da histona desacetilase (HDAC) in vivo (Shimazu et al., 2013) Após 1 mês no KD, os níveis totais de acetil-Lys aumentaram 5 vezes no fígado de camundongos KD em comparação com os camundongos controle e LCD ( Figura 3 E). Um aumento de 2,5 vezes foi detectado no músculo esquelético dos mesmos camundongos ( Figura S3 ). O nível de p53 acetilado, uma importante proteína supressora de tumor, foi 10 vezes maior no fígado após 1 mês em um KD ( Figura 3F). Curiosamente, os níveis de acetilação da histona 3 em Lys9 (H3K9) aumentaram no fígado após 1 mês em um KD ou em um LCD ( Figura 3 G). A inibição do HDAC e a acetilação do H3K9 pelo βHB também demonstraram regular a expressão gênica do Foxo3a e de alguns de seus alvos envolvidos nas respostas antioxidantes (Shimazu et al., 2013), incluindo superóxido dismutase de manganês (MnSOD). Os níveis de proteína FoxO3a e MnSOD aumentaram no fígado após 1 mês de um LCD ou KD em comparação com uma dieta controle ( Figuras 3 H e S2 ).

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Figura 3 Alterações na acetilação de proteínas e sinalização de mTOR no fígado de ratos machos após 1 mês de dietaMostrar legenda completaVer imagem ampliadaVisualizador de figuraDownload da imagem em alta resoluçãoDownload (PPT)

Para elucidar ainda mais os mecanismos subjacentes aos efeitos benéficos de uma KD na longevidade e no tempo de vida, examinamos os níveis e o estado de ativação de vários fatores ligados ao alvo mecanicista da via de sinalização do complexo 1 da rapamicina (mTOR) (mTOR) (mTORC1), que foi sugerido para modular o envelhecimento em resposta a intervenções alimentares (McDaniel et al., 2011Klement e Champ, 2014Solon-Biet et al., 2014) Os níveis totais e fosforilados de mTOR não foram alterados no fígado por 1 mês de LCD ou KD ( Figuras 3 A e S2 ). 

No entanto, foram detectados níveis mais baixos de proteína 1E de ligação fosforilada 1 (4E-BP1) e uma tendência semelhante para a proteína ribossômica S6 fosforilada (rpS6), sugerindo diminuição da sinalização de mTORC1 ( Figuras 3 B e 3C) no fígado. 

Ao contrário do fígado, os níveis de p-4E-BP1 aumentaram no músculo esquelético de camundongos cetogênicos após 1 mês de dieta ( Figura S3) Também analisamos várias cascatas de sinalização modulando a detecção de nutrientes hepáticos pelo mTORC1. 

Não foram detectadas alterações na AMPK fosforilada, p-Akt ou p-Erk1 / 2 entre os ratos controle e KD. A fosforilação do complexo de esclerose tuberosa 2 (TSC2) em S939 ou S1387, bem como os níveis de p-Raptor, também não foi alterada pelo KD ( Figura S2 ). Por outro lado, os níveis de proteína transcrita induzível a danos no DNA 4 (DDIT4, também conhecida como regulada no desenvolvimento e no DNA ou REDD1), um regulador negativo do mTORC1, aumentaram significativamente nos camundongos KD ( Figura 3 D).

Discussão

O objetivo deste estudo foi imitar as alterações metabólicas que acompanham o CR, manipulando a composição de macronutrientes na dieta e determinar se essas alterações na composição da dieta aumentam a longevidade e a saúde dos ratos. Os resultados demonstram claramente que a vida útil é aumentada em camundongos que consomem um KD em comparação com uma dieta controle padrão. No entanto, estratégias de alimentação e questões de criação podem desempenhar um papel na determinação da influência das DKs no envelhecimento. Essa hipótese é corroborada pelo fato de um estudo anterior ter relatado que os KDs não alteram as curvas de sobrevivência em camundongos C57BL / 6 (Douris et al., 2015) É importante observar que a vida útil do grupo controle relatada por Douris e colegas foi menor do que seria esperado para essa cepa (Yuan et al., 2009

O nível de ingestão de energia e a prevenção do ganho de peso podem ser particularmente importantes para efeitos positivos da vida útil de um KD, e os resultados do presente estudo sugerem que a longevidade aumenta quando uma estratégia de alimentação é seguida, mitigando o ganho de peso em camundongos adultos.

Semelhante aos KDs, pouco se sabe sobre o impacto dos LCDs na longevidade em animais que não têm acesso ad libitum aos alimentos. Supõe-se frequentemente que dietas ricas em gordura reduzem a vida útil, uma vez que demonstraram induzir ganho de peso e obesidade quando alimentadas ad libitum a camundongos C57BL / 6 (Surwit et al., 1995) No entanto, nossos resultados indicam que um LCD controlado por calorias iniciado em camundongos de meia idade não tem um impacto negativo no envelhecimento.

Houve um interesse considerável no impacto da composição de macronutrientes na longevidade, com vários estudos focando a restrição de proteínas ou metionina como uma abordagem para aumentar a vida útil (Miller et al., 2005Orentreich et al., 1993

Em nosso estudo, a vida útil não diferiu significativamente entre os grupos LCD e KD, apesar da maior ingestão de proteínas em animais com LCD em comparação aos animais com KD. 

Além disso, não foi observado aumento na expectativa de vida em ratos alimentados com dietas nas quais o conteúdo de proteínas foi reduzido para níveis e, em proporção, comparável aos de nosso estudo (Nakagawa e Masana, 1971Ross e Bras, 1973) Outro estudo constatou que a sobrevivência não foi aumentada em ratos que consomem uma dieta proteica de 12% versus 20% (Davis et al., 1983) Assim, as evidências disponíveis não sustentam a ideia de que o nível de proteína é o principal responsável pelo aumento da longevidade em nossos camundongos KD. Também foi proposto que uma baixa proporção de proteína na dieta / carboidrato leva à longevidade (Solon-Biet et al., 2014

No entanto, os resultados do presente estudo não são consistentes com essa hipótese. No entanto, são necessários estudos adicionais para determinar se a proteína da dieta contribui para melhorar a função fisiológica e a longevidade em camundongos KD. 

Também é possível que a composição ideal de macronutrientes na dieta possa diferir entre um animal que é alimentado ad libitum e um que não é.Nossos resultados mostram que um KD retarda o declínio cognitivo e preserva a função motora em camundongos idosos. 

Deve-se notar que, embora o LCD não diferisse significativamente do grupo cetogênico na longevidade, as duas dietas diferiam em sua capacidade de preservar a função fisiológica com a idade. 

Isso sugere que as cetonas podem ser necessárias para provocar uma extensão da saúde.O novo teste de reconhecimento de objetos foi usado anteriormente para estudar a memória em modelos de envelhecimento e suas doenças associadas (Fahlström et al., 2012Stover et al., 2015)

 Nossos resultados apóiam a noção de que as cetonas podem desempenhar um papel importante como moléculas de sinalização neoprotetor (Newman e Verdin, 2014) Um suporte adicional a essa hipótese vem do fato de que uma dieta que imita o jejum também aumenta a produção de cetona e melhora a memória em ratos (Brandhorst et al., 2015) O presente estudo, juntamente com a literatura, apóia a noção de que um KD promove saúde cognitiva a longo prazo.A função motora foi avaliada com abordagens usadas anteriormente para detectar déficits relacionados à idade na força e função muscular (Fahlström et al., 2012Justice et al., 2014

Os camundongos KD não mostraram a diminuição relacionada à idade na força de preensão observada nos camundongos controle, e os camundongos KD, com 26 meses de idade, superaram os outros grupos da dieta no teste do fio pendurado.

 Isso sugere que o KD maximiza e preserva a força de preensão do membro anterior com a idade. Há evidências de que o acetoacetato do corpo cetônico desempenha um papel importante como molécula sinalizadora nas células musculares, independentemente de seus efeitos metabólicos (Zou et al., 2016) Foi demonstrado que o acetoacetato melhora os resultados da distrofia muscular e acelera a regeneração muscular, sugerindo que ele pode ser um ator importante na atenuação do declínio relacionado à idade na função muscular. Os resultados de nossos testes e o trabalho de outros sugerem que as cetonas afetam positivamente a homeostase muscular. No entanto, é necessário mais trabalho para elucidar os mecanismos exatos subjacentes a esse efeito protetor.De acordo com nossos resultados, a extensão da longevidade e da saúde parece ser exclusiva do KD. Curiosamente, há evidências de interação entre corpos cetônicos e vias propostas para modular o envelhecimento.O corpo da cetona βHB é um inibidor direto dos HDACs, um processo que demonstrou ocorrer in vivo (Shimazu et al., 2013Newman e Verdin, 2014) Os inibidores de HDAC prolongam a vida útil em modelos de leveduras a moscas, através de mecanismos ainda não elucidados, mas associados à hiperacetilação de histonas e a um grande número de outras proteínas. Em nosso estudo, um KD resultou em um aumento dramático nos níveis totais de lisina acetilada. Curiosamente, tanto nos camundongos LCD quanto nos KD, observamos um aumento no acetil-H3K9, concomitante ao aumento de FoxO3a e MnSOD no fígado, um efeito descrito anteriormente na literatura como uma contribuição dos corpos cetônicos para as vias de resposta ao estresse e potencialmente longevidade (Shimokawa et al., 2015Shimazu et al., 2013) No entanto, como o efeito sobre o acetil-H3K9, FoxO3a e MnSOD foi semelhante nos grupos LCD e KD, nossos dados sugerem que essas alterações não estão subjacentes à expectativa de vida e à saúde da dieta.Foi demonstrado que muitas intervenções dietéticas que prolongam ou modulam a vida útil são mediadas, pelo menos parcialmente, pela atividade reduzida de mTORC1 (Houtkooper et al., 2010), um efeito que foi relatado anteriormente com KDs (McDaniel et al., 2011

O menor teor de proteínas no KD provavelmente contribui para uma menor atividade da mTORC1, provocando uma resposta análoga à da restrição de proteínas ou metionina (Pissios et al., 2013) Nosso projeto experimental tentou minimizar esse efeito usando um teor mais alto de proteínas (10% de calorias) do que os estudos anteriores de roedores em laboratório sobre KDs e restrição de proteínas (Douris et al., 2015Levine et al., 2014)Detectamos uma modulação dependente de tecido da sinalização de mTORC1. No músculo esquelético, o KD aumentou os níveis de p-4E-BP1. Da mesma forma, um estudo recente em ratos alimentados com um KD de proteína relativamente alta (± 20% kcal) não detectou alterações no p-rpS6 e uma tendência para o aumento do p-4E-BP1 (Roberts et al., 2016) Assim, o nível de proteína pode ter uma grande influência no sinal mTORC1 em resposta a um KD. Existe uma falta de entendimento suficiente da troca entre a modulação pró-longevidade do mTOR e a homeostase do músculo esquelético (Sharples et al., 2015), e mais pesquisas são necessárias para entender completamente os mecanismos responsáveis ​​pela preservação da massa muscular com o envelhecimento em nossos ratos KD. No fígado, no entanto, mostramos que a sinalização de mTORC1 é inibida pelo KD. Curiosamente, foi relatado que a hiperacetilação da p53 inibe a mTORC1 em resposta ao jejum, aumentando a expressão de Ddit4, um regulador negativo da mTORC1 (Schupp et al., 2013) Além disso, esse mesmo caminho parece mediar os efeitos da metformina (Ben Sahra et al., 2011) Nossos resultados, incluindo aumento da acetilação da p53 e dos níveis de DDIT4 e diminuição da sinalização a jusante de mTORC1, somente no grupo cetogênico estão de acordo com este modelo. 

De notar, a hiperacetilação e estabilização de p53 também podem estar contribuindo para a diminuição acentuada da incidência de câncer nos camundongos KD. A diafonia entre a inibição de HDAC e a sinalização de mTORC1 no fígado é, portanto, um mecanismo potencial que contribui para a extensão da longevidade com um KD.

Um objetivo do presente estudo foi determinar se um KD poderia imitar as mudanças no tempo de vida e na longevidade induzidas pelo CR. O KD induziu algumas das mesmas alterações relatadas com CR. Em particular, a vida útil geral é aumentada por ambos os CR (Speakman e Mitchell, 2011) e o KD. 

A β-oxidação de ácidos graxos e a produção de βHB são estimuladas (Mahoney et al., 2006) e a acetilação da proteína aumenta conforme descrito em estudos anteriores de RC (Schwer et al., 2009) A sinalização a jusante do mTORC1 também é regulada no fígado com ambos os CR (Miller et al., 2013) e um KD.

O KD, no entanto, também mostrou várias diferenças em relação ao CR. Diferentemente da RC, os camundongos KD no presente trabalho eram intolerantes à glicose em comparação aos controles, em contraste com os relatórios anteriores de maior tolerância à glicose na KD alimentada ad libitum (Douris et al., 2015) Além disso, o nível de ingestão de KD no presente estudo não produziu a diminuição do peso corporal observada com uma dieta CR.

Este estudo demonstra que os LCDs com alto teor de gordura controlados por energia não são prejudiciais à saúde, mas um KD prolonga a vida útil e diminui o declínio relacionado à idade na função fisiológica em camundongos. 

Estudos futuros são necessários para investigar mais detalhadamente os mecanismos pelos quais essa dieta funciona e otimizar a composição da dieta e as abordagens alimentares para ampliar ainda mais a expectativa de vida.

Métodos STAR ★

 Tabela de Recursos Principais

REAGENTE ou RECURSOFONTEIDENTIFICADOR
Anticorpos
Anti-AMPKα monoclonal de coelhoSinalização CelularCat # 5831; RRID: AB_10622186
Anti-fosfo-AMPKα monoclonal de coelho (Thr172)Sinalização CelularCat # 2535; RRID: AB_331250
Anti-tuberina policlonal de coelho / TSC2Sinalização CelularCat # 3612; RRID: AB_2207804
Anti-fosfo-tuberina policlonal de coelho / TSC2 (Ser939)Sinalização CelularCat # 3615; RRID: AB_2207796
Anti-fosfo-tuberina policlonal de coelho / TSC2 (Ser1387)Sinalização CelularCat # 5584; RRID: AB_10698883
MAPK monoclonal de coelho anti-44 / 42 (Erk1 / 2)Sinalização CelularCat#4695; RRID: AB_390779
Rabbit polyclonal anti-phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204)Cell SignalingCat#9101; RRID: AB_331646
Rabbit polyclonal anti-mTORCell SignalingCat#2972; RRID: AB_330978
Rabbit polyclonal anti-phospho-mTOR (Ser2448)Cell SignalingCat#2971; RRID: AB_330970
Rabbit monoclonal anti-4E-BP1Cell SignalingCat#9644; RRID: AB_2097841
Rabbit monoclonal anti-phospho-4E-BP1 (Thr37/46)Cell SignalingCat#2855; RRID: AB_560835
Mouse monoclonal anti-S6 ribosomal proteinCell SignalingCat#2317; RRID: AB_2238583
Rabbit monoclonal anti-phospho-S6 ribosomal protein (Ser240/244)Cell SignalingCat#5364; RRID: AB_10694233
Rabbit monoclonal anti-histone H3 (Lys9)Cell SignalingCat#9649; RRID: AB_2561046
Rabbit polyclonal anti-acetylated-lysineCell SignalingCat#9441; RRID: AB_331805
Rabbit polyclonal anti-acetyl-p53 (Lys382)Cell SignalingCat#2525; RRID: AB_330083
Rabbit monoclonal anti-acetyl-histone H3 (Lys9)Cell SignalingCat#9649; RRID: AB_2561046
Rabbit polyclonal anti-REDD1Proteintech GroupCat#10638-1-AP; RRID: AB_2245711
Rabbit monoclonal anti-p70 S6KCell SignalingCat#2708; RRID: AB_390722
Rabbit monoclonal anti-phospho-p70 S6K(Thr389)Cell SignalingCat#9234; RRID: AB_2269803
Goat anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibody, HRPThermo FisherCat#31460; RRID: AB_228341
Goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody, HRPThermo FisherCat#31430; RRID: AB_228307
Chemicals, Peptides, and Recombinant Proteins
Chow dietLabDietCat#5001
CaseinDyetsCat#400627
L-cysteinDyetsCat#401340
D-methionineDyetsCat#402950
Corn starchHoneyvilleCat#007-373-011
MaltodextrinHoneyvilleCat#007-345-0341
SucroseC&HN/A
Soybean oilSunny Select, Super Store IndustriesN/A
LardArmour, ConAgra FoodsN/A
Choline bitartrateDyetsCat#400750
CelluloseMP BiomedicalsCat#02900453
Tert-butylhydroquinoneDyetsCat#404455
Calcium phosphate, dibasicDyetsCat#400940
Mineral mix (LCD and control)Envigo (Indianapolis, IN)Cat#TD94046
Vitamin mix (LCD and control)Envigo (Indianapolis, IN)Cat#TD94047
Mineral mix (KD)Envigo (Indianapolis, IN)Cat#TD79055
Vitamin mix (KD)Envigo (Indianapolis, IN)Cat#TD40060
Calcium carbonateSigma-AldrichCat#C4830
50% dextroseHospiraNDC0409-6648-02
InsulinNovo NordiskNDC0169-1833-11
0.9% salineAPP PharmaceuticalsCat#918610
Critical Commercial Assays
Non-esterified fatty acids – Color Reagent A, Solvent AWako DiagnosticsCat# 999-34691, 995-34791
Triglycerides reagentThermo Fisher ScientificCat#TR22421
Total cholesterol reagentsThermo Fisher ScientificCat#TR13421
LDL/VLDL precipitating bufferAbcamCat#ab105138
FGF21 Quantikine ELISA kitR&D SystemsCat#MF2100
VPLEX proinflammatory panel customized to measure IL6, KC/GRO, and TNF-αMeso ScaleCat#K15048D
Experimental Models: Organisms/Strains
Mouse: C57BL/6NIA Aged Rodent ColonyN/A
Software and Algorithms
SAS Version 9.4SAShttps://www.sas.com/en_us/software/sas9.html
Image Lab 5.0Bio-Radhttp://www.bio-rad.com/en-us/product/image-lab-software
Other
EchoMRIEchoMRI LLC, Houston, TXEchoMRI-100H
Clear cylinder, 15 cm diameter (rearing test)Tap plasticsN/A, custom made
Plexiglas box (novel object test)Tap plasticsN/A, custom made
Push-pull force scale (grip strength test)Imada (Northbrook, IL)PS-500N
LocotronicIntellibio Innovation, Karlsruhe, Germanyhttp://www.intelli-bio.com/en/behavioural-research/locomotion/motor-coordination/locotronic
Precision Xtra blood glucose and ketone monitorAbbottN/A
Easy Plus II glucometerHome Aid DiagnosticN/A
Precision Xtra blood ketone test stripsAbbottN/A
Tiras de teste Easy Plus II Easy TalkHome Aid DiagnosticN / D
Sistema de calorimetria Oxymax / CLAMSColumbus Instruments, Columbus, OHN / D
CO 2 e O 2 calibration gasAirgas, Sacramento, CAN / D
Sistema de infusão de gases OxyValColumbus Instruments, Columbus, OHN / D
Sistema de fotocélulas por infravermelhoColumbus Instruments, Columbus, OHN / D
Sistema ChemiDoc MPBio-RadGato # 17001402

 Contato para compartilhamento de reagentes e fontes

Mais informações e solicitações de recursos e reagentes devem ser direcionadas e serão atendidas pelo contato principal, Jon J. Ramsey ( jjramsey@ucdavis.edu ).

 Modelo experimental e detalhes do assunto

 Criação animal

Camundongos machos C57BL / 6 foram obtidos aos 11 meses de idade da NIA Aged Roent Colony e alojados em gaiolas de policarbonato em racks em uma sala com temperatura controlada (22-24 ° C) e umidade (40-60%). Os ratos foram alojados individualmente em uma sala filtrada por HEPA mantida em um ciclo claro-escuro de 12 horas. Verificações de saúde foram realizadas em todos os ratos pelo menos uma vez ao dia. Os animais que apresentaram dermatite tiveram unhas cortadas por um técnico treinado e foram tratadas topicamente com 2% de clorohexidina diariamente até a lesão se resolver. Os camundongos eram considerados moribundos se não pudessem alcançar comida ou água, não respondessem a estímulos externos ou apresentassem um tumor ulcerado. Os ratos Sentinel foram alojados na mesma sala e expostos à cama dos ratos do estudo semanalmente. Os exames de saúde foram concluídos em camundongos sentinela a cada três meses. Os testes incluíram culturas aeróbicas e sorologia (MHV, MPV, MVM, M. pul., TMEV [GDVII], Ectro, EDIM, MAD1, MAD2, LCM, Reo-3). Todos os testes foram negativos ao longo do estudo. Todos os protocolos de animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidado e Uso de Animais da UC Davis e estavam de acordo com as diretrizes do NIH para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório.

 Intervenções alimentares

Ingrediente (g / kg de dieta)Ao controleBaixo carboidratoCetogênico
Proteínas, das quais203316,7183,7
Caseína200312181
L-cisteína34.7
D-metionina2.7
Carboidratos, dos quais630112
Amido de milho398
Maltodextrina132
Sacarose100112
Gorduras, das quais70423631
Óleo de soja707070
Banha353561
Bitartarato de colina2.52.5
Celulose (73,5 mg / dia)50.7185
Tert-butil-hidroquinona0,0140,0850,126
Mistura mineral356060
Mistura de vitaminas101513
Outros minerais27,5

‡, incluído na mistura vitamínica

Para as dietas controle e LC, foram utilizadas a mistura mineral Envigo (Indianapolis, IN) TD94046 e a mistura vitamínica TD94047. O KD incluiu as misturas TD79055 (mistura mineral) e TD40060 (mistura vitamínica), devido ao seu menor conteúdo em carboidratos. Como conseqüência, foi necessária a suplementação de fosfato de cálcio (19,3 g / kg de dieta) e carbonato de cálcio (8,2 g / kg de dieta). A mistura de vitaminas adicionada ao KD incluiu colina (citrato de di-hidrogênio e colina) para uma concentração final de 4,5 g / kg de dieta.Para o estudo da vida útil, 43-44 camundongos foram aleatoriamente designados para cada grupo da dieta. Os ratos foram autorizados a viver sua vida natural e foram sacrificados apenas se moribundos. Além disso, para cada dieta, 15 ratos foram testados aos 13 meses de idade e um grupo separado de 20 ratos aos 26 meses de idade. Subconjuntos dos camundongos foram sacrificados por deslocamento cervical para coleta de tecido ou por overdose de CO 2 .

 Detalhes do método

 Peso corporal e composição

O peso corporal foi medido semanalmente. A composição corporal foi avaliada usando relaxometria de RMN (EchoMRI-100H, EchoMRI LLC, Houston, TX) aos 13, 17, 22 e 26 meses de idade.

 Testes de comportamento

 Novo teste de reconhecimento de objetos

O novo teste de reconhecimento de objetos foi realizado em uma caixa de plástico transparente (16 ”x16” x16 ”) embrulhada em papel branco. O dia 1 consistiu em uma habituação ambiental de 5 min. 

O dia 2 consistiu em um período de familiarização de 10 minutos com dois objetos idênticos (caixas ou garrafas de plástico) e um teste de 10 minutos com um objeto conhecido e um novo objeto (uma caixa e uma garrafa). Uma câmera de vídeo foi usada para gravar os testes no dia 2.

O período de familiarização e o teste de novos objetos foram realizados com uma diferença de 6 horas. O tempo gasto nos objetos novos e conhecidos foi registrado. O teste foi concluído quando o tempo total de exploração atingiu 20 s ou o mouse atingiu o tempo de corte de 10 min.

 Força de preensão

A força de preensão do membro anterior foi medida usando a balança de força de tração Imada (PS-500N, Northbrook, IL) e uma única barra de metal. Os ratos foram posicionados para agarrar a barra apenas com membros anteriores e depois puxados horizontalmente até serem soltos. O teste foi realizado em camundongos em jejum usando duas rodadas de três ensaios cada.

 Entre os ensaios, os ratos receberam descanso mínimo (30 s); entre as rodadas, os ratos foram devolvidos à sua gaiola para descansar (45 min). A força máxima de preensão dos 6 testes totais foi registrada.

 Teste de suspensão do fio

Resistência e coordenação foram testadas usando o teste do fio pendurado. Uma barra de arame (3 mm de diâmetro) foi suspensa na parte superior de uma caixa de plástico transparente (16 ”x16” x16 ”) forrada com estofamento. Os ratos foram posicionados no centro do fio, pendurados apenas nos membros anteriores. A “pontuação decrescente” inicial foi registrada como 10. Uma queda foi registrada quando o mouse caiu do fio para o preenchimento abaixo. A cada queda, a pontuação diminui em um. Quando o rato caiu pelos membros posteriores, a queda foi considerada voluntária e não foi contada. Após uma queda ou sempre que o mouse alcançava uma das extremidades do fio, ele era imediatamente colocado de volta na posição original no centro do fio. O procedimento foi repetido até que a pontuação em queda chegasse a zero ou o tempo total pendente atingisse 3 min.

 Locotronic

O teste Locotronic (Intellibio Innovation, Karlsruhe, Alemanha) foi realizado em ratos em jejum imediatamente após a transferência do quarto pela manhã. Os ratos foram colocados no corredor Locotronic na zona inicial. Uma régua foi mantida atrás de cada animal para garantir que continuasse na direção de avanço em direção à zona de chegada. O tempo foi registrado por três rodadas por mouse. Essas rodadas incluíam uma corrida de treinamento, a prova nº 1 com todos os degraus da escada no lugar e a prova nº 2 com degraus removidos (armadilhas definidas nas posições 10, 20 e 50 na escada).

 Teste de criação

Os ratos foram colocados em um grande cilindro transparente (15 cm de diâmetro). A latência para subir e o número de partes traseiras em 5 minutos foram registrados usando a análise de câmera de vídeo. Uma “traseira” foi definida como colocar as duas patas dianteiras na lateral do cilindro.

 Cetonas no sangue

Os níveis de cetona no sangue foram medidos 3 horas após a prandial usando o sistema de monitoramento de glicose e cetona Precision Xtra (Abbott) de acordo com as instruções do fabricante.

 Testes de tolerância à glicose e insulina

Para o GTT, os ratos foram submetidos a jejum durante a noite e injetados intraperitonealmente com glicose (1 g / kg de peso corporal). Para o ITT, os ratos foram submetidos a jejum por 4 horas e a injeção de IP com 0,75 U / kg de peso corporal de insulina humana. A glicemia foi medida usando o glicosímetro Easy Plus II aos 0, 15, 30, 45, 60 e 120 min para ambos os testes.

 Calorimetria de respiração indireta e medição da atividade física

O gasto energético (EE) e o quociente respiratório (RQ) foram medidos usando calorimetria de respiração indireta de corpo inteiro (Columbus Instruments, Columbus, OH). O EE foi calculado a partir do consumo de O 2 e a produção de CO 2 e o RQ foram determinados como a razão entre o volume de CO 2 produzido e o volume de O 2 produzido. Feixes de infravermelho foram usados ​​para registrar a atividade de acordo com o número de eventos de quebra de feixe no plano horizontal (x) e vertical (z).O sistema de calorimetria Oxymax / CLAMS (Columbus Instruments, Columbus, OH) foi alojado em uma sala mantida em um ciclo de 12 horas de luz / 12 horas de escuridão a 22 ° C. Os camundongos foram colocados em gaiolas de aclimatação (câmaras de calorimetria não conectadas ao calorímetro) e alojados na sala Oxymax / CLAMS por 24 horas. Os camundongos foram então transferidos para câmaras de calorimetria contidas em uma incubadora a 22 ° C e deixados se aclimatar por 24 horas antes do início das medições de calorimetria. As medições de calorimetria foram então concluídas durante um período de 48 horas. O ar ambiente foi aspirado através das câmaras de calorimetria a 500 ml / min. Amostras de ar seco da sala e da câmara foram analisadas quanto ao teor de oxigênio e dióxido de carbono usando o sistema Oxymax. A calibração do calorímetro foi realizada diariamente antes do início de cada medição de 24 horas. A 0,50% de CO 2e 20,50% de OForam utilizados 2 gases de calibração (nitrogênio balanceado) (Airgas, Sacramento, CA) e ar seco para calibrar os analisadores. No início e no final das experiências, o desempenho de todo o sistema de calorimetria foi validado através da sangria de um padrão de 20% de CO 2 (nitrogênio balanceado) (Airgas, Sacramento) em cada câmara de calorimetria a uma taxa regulada usando um sistema de infusão de gás OxyVal ( Columbus Instruments, Columbus, OH) e medindo a recuperação da diluição de CO 2 e O 2 no escape da câmara.

 Análise de soro

A coleta de sangue foi realizada por punção cardíaca. O soro foi obtido após a coagulação e centrifugação (1000 g, 10 min) e enviado ao Centro de Fenotipagem Metabólica UC Davis para análise. Os seguintes ensaios séricos foram concluídos usando kits de acordo com as instruções do fabricante: ácidos graxos livres (Wako Diagnostics, Richmond, VA), triglicerídeos (Fisher Diagnostics, Middletown, VA) e colesterol total, colesterol HDL, colesterol LDL e VLDL o colesterol (Fisher Diagnostics, Middletown, VA) foi medido utilizando ensaios colorimétricos enzimáticos. A IL-6, CXCL1 e TNF-a foram determinadas por ELISA (Meso Scale Discovery, Rockville, MD).

 Imunodetecção de proteínas

Os fígados congelados foram pulverizados e homogeneizados em tampão de lise de sacarose (Tris 50 mM, pH 7,5, sacarose 250 mM, EDTA 1 mM, EGTA 1 mM, EGTA 1 mM, Triton X-100 a 1% e inibidores de protease). O sobrenadante foi coletado após centrifugação a 10.000 gpor 5 min. 20 μg de proteína foram submetidos a SDS-PAGE em géis de TGX com critério de 4 a 20% (Bio-Rad) e transferidos para membranas de nitrocelulose por 2 horas. As membranas foram bloqueadas em gelatina de pele de peixe a 1% dissolvida em solução salina tamponada com Tris com Tween-20 a 0,1% durante 1 hora e depois sondadas com anticorpo primário durante a noite a 4 ° C. As membranas foram então incubadas com anticorpos secundários conjugados com HRP a 1: 10.000 por 1 hora à temperatura ambiente. O substrato HRP quimioluminescente Immobilon Western (Millipore) foi então aplicado às membranas para visualização da banda de proteínas. A quantificação foi realizada usando o software ChemiDoc MP System e Image Lab 5.0 (Bio-Rad). A coloração total de proteínas da membrana (via Ponceau) foi usada como controle de normalização.

 Patologia

Após a morte, os ratos no estudo de vida foram colocados em uma solução de formalina a 10% após a abertura das cavidades abdominal, torácica e craniana. Uma seleção aleatória desses camundongos de cada dieta foi submetida ao Laboratório de Patologia Comparada da UC Davis para necropsia e exame histológico. Os tecidos processados ​​para exame histológico incluíam fígado, cérebro, pulmões e trato respiratório superior, baço, pâncreas, trato reprodutivo, coração e grandes vasos, timo, linfonodos, trato gastrointestinal, trato urinário, pele de cabelos, orelhas, olhos e músculo esquelético. Tecidos adicionais foram examinados se lesões graves foram observadas na necropsia. Os tecidos foram processados ​​e embebidos em parafina por métodos de rotina. Os tecidos (seções de 5 μm) foram corados com hematoxilina e eosina para avaliação histológica.

 Quantificação e Análise Estatística

Todos os dados são expressos como média ± SEM, salvo indicação em contrário. As diferenças entre grupos de dieta e idades foram avaliadas usando uma análise de variância bidirecional. A análise post hoc foi realizada usando um teste honesto de diferença significativa de Tukey para determinar quais dietas e faixas etárias diferiam significativamente. Para dados de gasto de energia, a análise de covariância foi usada com PC ou massa magra como covariável no modelo. 

As curvas de sobrevida para cada grupo da dieta foram estimadas usando o método Kaplan-Meier e as diferenças na sobrevivência entre os grupos da dieta foram testadas usando testes log rank e um teste de Tukey para manter a taxa de erro tipo I familiar em 0,05. Os testes exatos de Fisher foram utilizados para determinar associações entre dieta e histologia para dados de patologia. A significância foi determinada como p <0,05 nos dois lados.

Contribuições do autor

JJR, JAL-D. E KH conceberam o estudo; JJR, JAL-D. E MNR projetaram os experimentos; JAL-D., MNR, DT, ZZ, EG-C. E MZM realizaram os testes fisiológicos e comportamentais; MAW, GRM e AAT avaliaram os níveis de proteína; SK realizou o ITT; DT e GP supervisionaram a colônia de vida útil; KK e TAK realizaram as análises estatísticas; SMG e DMI realizaram a análise histopatológica; KB, GAC e FGH contribuíram para a discussão e interpretação dos dados; e MNR, JAL-D. e JJR escreveram o artigo com contribuições de todos os autores.

Agradecimentos

Este trabalho foi financiado por um Projeto de Projeto (2P01AG025532) do NIH (EUA) e pelo centro de fenotipagem metabólica de camundongos UC Davis (U2CDK092993).

Informação complementar

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Artigo Info

Histórico da publicação

Publicado: 5 de setembro de 2017; corrigido online: 9 de abril de 2018Aceito: 7 de agosto de 2017Recebido em forma revisada: 4 de maio de 2017Recebido: 20 de janeiro de 2017

Identificação

DOI: https://doi.org/10.1016/j.cmet.2017.08.005

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Figuras

  • Resumo Gráfico
  • Figura 1 Efeito de dietas com baixo teor de carboidratos na longevidade e no tempo de vida em ratos machos
  • Figura 2 Adaptações metabólicas de ratos machos a dietas com baixo teor de carboidratos
  • Figura 3 Alterações na acetilação de proteínas e sinalização de mTOR no fígado de ratos machos após 1 mês de dieta

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